【求助】SYBR溶解曲线双峰求解

最新回复

• hyuu (2015-10-09 13:56:19)

  建议用电泳检测一下定量PCR产物，因为你的产物峰看上去不是很Sharp，怀疑产物并不单一，可能有弥散之类的，如果是这样的话定量结果没有意义。

• 西子 (2015-10-09 13:56:33)

  
  谢谢！弥散是什么意思啊？补充一下，前面的峰是一个标本，后面的峰是另外一个标本，有没有可能突变之类的呢？

• hyuu (2015-10-09 13:57:03)

  弥散就是一般所说的smear，电泳中看上去没有特意条带，会呈现出泳道内一段区域均匀分布着产物的现象。至于是否有突变个人觉得不太好说，如果你电泳检测没问题的话可以送去测序鉴定。但是普通定量的熔链曲线是不能用于检测突变的，需要用高分辨熔链曲线（HRM)。

• caihong (2015-10-09 13:57:18)

  
  这个结果应该可以用的，可以大概的跑下电泳看看，如果不是这个基因目的片段区域有多态性存在，那就可能是仪器本身的的信号采集时的问题，起始位置几乎相同

• bgf5 (2015-10-09 13:58:50)

  
  一般情况下，如果qPCR溶解曲线出现双峰的情况，是由于引物的非特异性扩增引起的，可以重新设计引物。

• 西子 (2015-10-09 13:59:35)

  继续发几张，总是出现不同的峰，准备跑个胶试试

  
  44886423.jpg

  
  53206804.jpg

  
  31245655.jpg

• 西子 (2015-10-09 13:59:55)

  QUOTE:

  原帖由 hyuu 于 2015-10-9 13:57 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  弥散就是一般所说的smear，电泳中看上去没有特意条带，会呈现出泳道内一段区域均匀分布着产物的现象。至于是否有突变个人觉得不太好说，如果你电泳检测没问题的话可以送去测序鉴定。但是普通定量的熔链曲线是不能用于检测 ...

  多谢解答，还有点疑虑请教。引物经过简单PCR跑胶验证过，有明显的条带。那么为什么SYBR定量PCR就扩不出来特意条带呢？

• hyuu (2015-10-09 14:00:47)

  QUOTE:

  原帖由 西子 于 2015-10-9 13:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  多谢解答，还有点疑虑请教。引物经过简单PCR跑胶验证过，有明显的条带。那么为什么SYBR定量PCR就扩不出来特意条带呢？

  你用的SYBR是商品化的Mix吗？如果是的话我就不清楚了。如果是自己配的Mix，那么确认配方正确，因为SYBR本身对PCR有抑制作用，需要多加镁离子。所以严格来说普通PCR好的话定量不一定就好。但是商品化的Mix一般没这个问题。

• hyuu (2015-10-09 14:02:00)

  QUOTE:

  原帖由 西子 于 2015-10-9 13:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  多谢解答，还有点疑虑请教。引物经过简单PCR跑胶验证过，有明显的条带。那么为什么SYBR定量PCR就扩不出来特意条带呢？

  你后面放的黄色曲线一定有杂带的。

• 西子 (2015-10-09 14:02:25)

  QUOTE:

  原帖由 hyuu 于 2015-10-9 14:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  你用的SYBR是商品化的Mix吗？如果是的话我就不清楚了。如果是自己配的Mix，那么确认配方正确，因为SYBR本身对PCR有抑制作用，需要多加镁离子。所以严格来说普通PCR好的话定量不一定就好。但是商品化的Mix一般没这个问题。 ...

  SYBR是商品化的Mix TAKARA的，同时跑的ACTIN和另外一个基因溶解曲线很好。黄色的线为何一定有杂带，其他的还好吗？数据能用吗？再次感谢！

• hyuu (2015-10-09 14:02:41)

  QUOTE:

  原帖由 西子 于 2015-10-9 14:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  SYBR是商品化的Mix TAKARA的，同时跑的ACTIN和另外一个基因溶解曲线很好。黄色的线为何一定有杂带，其他的还好吗？数据能用吗？再次感谢！

  后面贴的三张图都有扩增产物不纯的曲线，因为有很多曲线的峰都不sharp，个人认为这批数据不能用。

• 西子 (2015-10-09 14:03:08)

  感谢大家解答，跑了个胶，确实产物不纯，本来用普通PCR跑过胶验证的，没想到用SYBR PCR有两条带。只有重新设计引物了。

  
  41767377.snap.jpg

• wiwi (2015-10-09 14:04:27)

  我做miRNA的QPCR,用的染料法，扩增曲线正常，溶解曲线双峰，调整反应条件，仍然是双峰，什么原因？

• #问号# (2015-10-09 14:04:46)

  
  那就是有特异性扩增，能否重新设计引物啊？

• feixi (2015-10-09 14:05:13)

  
  LZ qPCR时的退火温度和普通的一样吗？还有出现双峰的话还和样品有关，我曾经也碰到过这样的问题

• misswu61 (2015-10-09 14:05:28)

  
  我也遇到了相同的状况，而且是标准曲线遇到了这个情况，请问楼主已经解决了嘛？是重新设计引物的还是？

• glass (2015-10-09 14:05:44)

  
  重新设计引物