【求助】realtime PCR 加样

最新回复

• ending (2015-11-10 11:02:27)

  
  将必须单独加的东西单加，其余的都配好混合以后在分加到各管中。
  由于很多情况下我多做几个基因的，所以加样时一般都是模板和引物单加，其余混合后再加，每次加样时都仔细看看枪头中是否有残留，如果有就尽量弄进去，如果不行，就仍了重新加。
  另外最好选择50ul体系，反应体系大一点可以降低一些加样误差。

• yizhi (2015-11-10 11:02:40)

  
  楼上的建议也正是我要说的。只有这样才可以保证减低复孔之间的误差。

• seagate (2015-11-10 11:03:26)

  
  用进口枪头加样吧，残留比较少

• yizhi (2015-11-10 11:03:45)

  
  进口枪头也会存在残留问题。只要能保证每次残留一样，也可以啊。：）

• PCR (2015-11-10 11:04:06)

  
  进口枪头也会存在残留问题。只要能保证每次残留一样，也可以啊。：）

• u234 (2015-11-10 11:04:20)

  建议用AXYGEN的枪头加样，和国产的枪头价格相差不大，有些国产枪头清洁质量不能保证，容易残留，最好枪头都已经灭菌。
  最好选择一把合适的枪，首先保证你使枪的本领过关。
  一般我是加好mix后，最后加cDNA，重复三复孔，如果非常重要的标本，可以用四复孔。
  离心转数可以加到3000rpm 2min，这样离心比较彻底。

• vvmmoy (2015-11-10 11:04:34)

  
  把模板和引物等都加到96孔板后，上PCR之间还要不要震荡和离心呢？

• toy (2015-11-10 11:04:54)

  我之前用的是八联管 但是现在订的是96孔板，订回来后才发现实验室没有96孔板的离心机，我想问一下要是加完样后不离心，可以吗 ？谢谢

• wood533 (2015-11-10 11:05:12)

  
  八联管和96孔板加好样后最好先在震荡器上震一下再离心，这样可以充分混匀使曲线更加平滑。如果不想震荡和离心，在配体系时（除样本以外的其他成分）一定要充分混匀，再分别加到96孔板里，加入样本时要吹打，注意不要有气泡和残留，也不能沾到管壁上，这需要手法熟练啊。

• yonger (2015-11-10 11:05:28)

  不知道你用的是什么型号的机器，加样的时候有很多技巧来避免孔与孔之间的差异，但是最好的办法还是ABI机器的ROX染料，用ROX染料可以来检测孔与孔的差异性。

• 小野花 (2015-11-10 11:05:43)

  
  我觉得用的PCR管子也有一定的关系，我用的国产的管子做完PCR后，每个管子里盛的溶液体积也不一样的，有的挥发的很厉害。不过没用过进口的管子，也许会好一点。

• junjie05 (2015-11-10 11:06:04)

  
  复孔的话，两个反应体系先加在一个EP孔中，再一分为二，这样的话复孔间的差异就很小了。