【求助】PCR无目的条带只有引物二聚体，如何解决？

最新回复

• whitesheep (2015-11-10 16:40:04)

  分析一下你的引物有没有问题

• caihong (2015-11-10 16:40:31)

  相关疾病：
  先天性卵巢发育不全综合征
  如果引物没有问题,建议做一个退火温度在45-55度之间的梯度PCR.

• wiwi (2015-11-10 16:41:09)

  引物是用Primer Premier 5.00 设计的，评分100。

• jude (2015-11-10 16:41:39)

  建议用oligo再分析一下引物,看3'端有没有二聚体,如果引物二聚体条带很亮的话,那肯定是引物与引物之间进行配对阔增了,根本就没有与模板结合,因为如果退火温度不合适,会有杂带出现,那么温度再提高1到2度就可以减少或消除杂带,如果只有引物二聚体,那就再进行一下优化,把退火温度再降低一两度看看,还有就是要做一下阳性对照,也就是换一套体系看看pcr反映体系中是不是有些成分失活了,还有模板,,最好把模板再跑一下电泳看一下有没有降解掉,如果这些情况都没问题,那就只能是引物问题了,另外,如果你的引物二聚体条带很亮,那肯定是引物问题

• bojitu (2015-11-10 16:41:56)

  
  想请教一下模版电泳是怎么跑法啊?

• bojitu (2015-11-10 16:43:04)

  
  和PCR 产物一样琼脂糖跑了

• nn255 (2015-11-10 16:44:13)

  PCR扩增不出现目的条带常需考虑以下原因：
  1. 模板
  1）模板中含有杂蛋白质；
  2）模板中含有Taq酶抑制剂；
  3）模板中蛋白质没有消除尽；
  4）在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚；
  5）模板核酸变性不彻底。
  2.酶失活
  需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶活性丧失或不够引起。
  3.引物
  要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应该大体一致。如亮度不一，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融。引物长度不够或引物之间形成二聚体也会影响结果。
  4.Mg离子浓度
  浓度过高可降低PCR扩增的特异性，过低则会使Taq酶不稳定。要详细阅读Taq酶的说明书。一般浓度为1.5-2.0mM。
  5.反应体积
  并非等倍增加相应反应物即可得到相似结果。
  6.物理原因
  变性温度低，时间短会增加非特异性扩增。变性温度过高，时间长会影响Taq酶的活性。需要阅读Taq说明书，标准条件为95℃，5min。
  7.靶序列变异
  另外尚需考虑是否加样时漏加Taq酶。
  内参条带清楚的话，考虑模板降解的可能性较小。
  建议把引物原液跑琼脂糖凝胶电泳先。

• wiwi (2015-11-10 16:44:45)

  如果引物没有问题,建议做一个退火温度在45-55度之间的梯度PCR.
  请问作梯度PCR有什么意义？

• cocacola (2015-11-10 16:45:02)

  
  相关疾病：
  先天性卵巢发育不全综合征
  引物有无问题主要包括一下几个方面:
  1. 去NCBI比对引物得特异性
  2.用oligo分析引物得特性,例如是否形成二聚体等
  3.合成问题,哈,这个只有找个好得合成公司了,不能只管合成价格啊.
  梯度pcr得意义:
  梯度pcr是用来摸索pcr时得最佳得退火温度得,因为无论是公司得合成订单还是软件给出得引物得Tm值都是一个参考值,毕竟关于Tm值有3中算法.理论上退火温度是比Tm值低5-10度,从此也可以看出退火温度需要摸索.
  和qiaozengpei前辈不同得建议是建议做45-60得梯度!

• caihong (2015-11-10 16:45:32)

  打分越高并不一定是越好的呀,我在设计引物的时候也有过同样的问题,明显最应该避讳的问题出现了 打分却是100分

• bojitu (2015-11-10 16:46:04)

  
  做梯度PCR时，PCR仪按照设置的温度范围自动生成一系列的温度梯度，每一列反应管温度一样，但是每一行反应管自左至右都是按梯度变化的。这样反应结束，跑电泳后可以根据电泳结果确定合适的退火温度。

• one (2015-11-10 16:46:22)

  请问各位大侠：我新合成的引物跑琼脂糖电泳没有条带，合成公司说要PAGE 电泳才能看出，也做过梯度pcr ，都没有结果，连引物二聚体都没有，只有像扫把一样的模糊一片，已经做了几个月了，都做不出结果，是什么原因呢 ？

• qqq111 (2015-11-10 16:46:39)

  
  不知您的问题解决了吗？我也遇到了同样的问题，想请问一下