【求助】RT-PCR实验求助

最新回复

• vvmmoy (2015-11-10 16:47:45)

  
  相关疾病：
  贫血
  一般3—5ml就可以了，但要看病人的情况了，如果有血液系统疾病如贫血可能需血量多一点。
  全血不可以直接冻存，因为如果象你这样保存血标本以后再做会溶血，影响结果。
  若要保存一批标本，可以先提出RNA再转录成cDNA再置于-20或-70度保存。

• hold住 (2015-11-10 16:48:09)

  
  非常感谢楼上的指教，请教如取血标本后不能马上处理提取总RNA，是否会影响结果？有无什么好办法？

• vera+ (2015-11-10 16:50:35)

  
  不知你用何种方法提取总RNA。千万不能全血冻存，可以在分离出单个核细胞后冻存，短期－20度，长期可－80度。我以前用TRIZOL试剂提取总RNA，此法可将TRIZOL加入单个核细胞中，然后冻存，攒一批标本后一块提取。我以前用此法做过不少标本，结果不错。

• vvmmoy (2015-11-10 16:50:54)

  
  取血标本后不能马上处理提取总RNA,可以用ficoll分离液将单个核细胞先分离出来，只留细胞沉淀－80度保存，也可以加入二甲亚砜等冻存液低温保存（这种方法比较规范）。

• vvmmoy (2015-11-10 16:51:47)

  
  冻存细胞时要缓慢冷冻，因为细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻时，细胞内外的水分都会很快形成冰晶，冰晶的形成将引起一系列的不良反应。首先细胞脱水使局部电解质浓度增高，PH值改变，部分蛋白质由于上述因素而变性，引起细胞内部空间的结构紊乱，细胞内冰晶的形成和细胞膜系统上的蛋白质、酶的变性，引起溶酶体膜的损伤使溶解酶释放造成细胞内结构成分的破坏，线粒体肿胀、功能丧失并造成细胞能量代谢的障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体在冷冻中易发生破坏引起胞膜通透性的改变、使细胞内容物丧失。细胞核内DNA也是冷冻时细胞易受损伤的部分，如细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成DNA的空间构型发生不可逆的损伤性变化，而引起细胞的死亡。故在细胞冻存时尽可能的均匀减少细胞内水分、减少细胞内冰晶的形成是减少细胞损伤的关键。
  而细胞复苏与冻存的要求相反，应采用快速融化的手段。这样可以保证细胞外结晶在很短时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成细胞内再结晶对细胞造成伤害。

• ujne (2015-11-10 16:52:03)

  
  我以前做的时候,一般取患者全血8ml,3小时内分离出血清,然后分装至离心管后-20度冰箱内保存.一般来说,每次做RT-PCR只需要50--100ul血清,所以可以根据你的需要决定所需的全血的量.但是,对部分血液科的患者,细胞量较少,可能需要的全血的量要多些.

• hold住 (2015-11-10 16:52:37)

  不知你用何种方法提取总RNA。千万不能全血冻存，可以在分离出单个核细胞后冻存，短期－20度，长期可－80度。我以前用TRIZOL试剂提取总RNA，此法可将TRIZOL加入单个核细胞中，然后冻存，攒一批标本后一块提取。我以前用此法做过不少标本，结果不错。
  再请教一下：如按hailzhj兄此法做，提取时是不是就不用再加TRIZOl了，直接融化后进行下一步就可以了？
  
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  还有楼上兄谈到冻存细胞时要缓慢冷冻和解冻时快速融化，这对我抽RNA影响大吗？缓慢冷冻和解冻时快速融化具体应如何操作，请详细说明，万分感谢！

• qhyu (2015-11-10 16:53:22)

  
  是啊，直接室温裂解就行了，这样对冻存的要求不高，我当时是－20度冻存的，因为不需进行细胞培养，所以对冻存条件要求不高，缓冻速溶是在进行细胞培养时的要求。

• duchy (2015-11-10 16:53:39)

  
  当然会有影响.但具体的我不是很清楚.
  我所知道的是,细胞株要放在液氮中冻存,每分钟下降温度1--2度.复苏时直接放到37度水浴中即可.

• duchy (2015-11-10 16:55:51)

  多谢各位高手指点。
  再请教一下：如按hailzhj兄此法做，提取时是不是就不用再加TRIZOl了，直接融化后进行下一步就可以了？
  还有yoyo781206兄谈到冻存细胞时要缓慢冷冻和解冻时快速融化，这对我抽RNA影响大吗？缓慢冷冻和解冻时快速融化具体应如何操作，请详细说明，万分感谢！
  ......
  应该说影响是比较大的
  如果在细胞冻存与复苏的过程中不太注意，有可能造成细胞的破坏，而细胞细胞破坏则会有大量的内源性RNA酶释放出来，如果你要提RNA的话，结果可想而知了，而且相对于外源性的RNA酶，其实在RNA的提取过程中最要注意的是内源性RNA酶，因为外源性的RNA酶可以通过各种方法加以清除以减少到最低。
  再谈谈细胞冻存与复苏的过程：有条件的话，最好用DMSO做保护剂，液氮保存，方法是：
  1、将细胞悬液收集至离心管中。
  2、1000转/分离心10分钟，弃上清。
  3、沉淀加含保护液的培养，计数，调整至5*10的六次方左右
  4、悬液分至冻存管，每管1ml。
  5、冻存管口封严。
  6、贴上标签，写明细胞种类，冻存日期。冻存管外栓一金属重物和一细绳。
  7、按下列顺序降温：室温到4度（20m），到冰箱冷冻室（30m），到低温冰箱（-30度，1h），到气态氮（30m），到液氮。
  复苏：
  1、在一1000ml的烧杯中，装2/3的37度的温水。
  2、从液氮中取出冻存管，迅速置于温水中并不断搅拌，使冻存管的冻存物在一分钟内融化。
  总之，有个原则：缓冻速融，细胞最易受损的温度在-5度到0度（复苏时要快速通过）

• 555444 (2015-11-10 16:58:29)

  
  各位大侠，大牛：
  刚开始做实验，请教个问题，准备用流式细胞仪，直接荧光标记法测定单核细胞TLR4的表达量及免疫组化染色测定单核细胞NF-κB p65含量，从血液中分离出来的单核细胞-80℃能保存多久？冷冻后会对实验结果有影响吗？