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【求助】RT-PCR法获取目的基因,怎样设计引物
【求助】RT-PCR法获取目的基因,怎样设计引物
最近想进行基因克隆,不知道通过RT-PCR法获取目的基因,怎样设计引物。是扩增目的基因的全序列还是部分序列,请不吝赐教。
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字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2015-12-01 11:31 作者: 98776langtao 来源: 分析测试百科网
最新回复
ALALA (2015-12-01 11:32:14)
GenBank 找到目的序列,用Primer设计你要的区域
=。
zhenxin (2015-12-01 11:32:32)
或者用别人使用过的引物,通过blast检验是否正确。
pore (2015-12-01 11:34:06)
请明确你的实验目的,是想进行基因克隆,还是检测表达,
如果是进行克隆,那么就应该是扩全长,若是检测就只要扩部分片段,
两者设计引物时,要求完全不同。
引物设计相关精华可参考:
http://www.dxy.cn/bbs/post/view? ... mp;tpg=1&age=-1
--------------
你的目的似乎是想扩出目的基因,所以应该是要扩全长。
步骤如下:
1。在genebank中搜到目的基因的全长mRNA序列;
2。确认目的片段的编码序列,也就是CDS;
3。根据CDS,在ATG及终止密码前后的序列来设计最佳引物;
--------------
以TNF为例,谈谈如何搜到目的序列:
首先进入NCBI主页,然后在搜索框中输入“TNF”,数据库选“Gene”;
55882957.jpg
pore (2015-12-01 11:34:26)
得到搜索结果708个,第一个就是我们要的结果,点击“TNF”。
85978588.snap.jpg
pore (2015-12-01 11:34:46)
进入TNF分子主页面。有关于TNF的详细描述及相关链接。
29067960.snap.jpg
pore (2015-12-01 11:35:25)
往下看,其中就有mRNA和protein的ID,点击mRNA的链接。
85051791.snap.jpg
pore (2015-12-01 11:36:05)
进入以下页面:
29133152.snap.jpg
pore (2015-12-01 11:36:23)
下拉,看其CDS序列,为170—871;
也就是说mRNA全长1669,但编码蛋白质的序列仅仅是从170-871bp处;
49201690.jpg
pore (2015-12-01 11:36:53)
设计引物时可以适当在ATG和TGA前后挪动,以获得最佳引物,但是余地不大。
同时要考虑装到载体上后,密码子不能移位,以确保正确地表达出蛋白。
72218608.snap.jpg
pore (2015-12-01 11:48:52)
设计引物时可以适当在ATG和TGA前后挪动,以获得最佳引物,但是余地不大。
同时要考虑装到载体上后,密码子不能移位,以确保正确地表达出蛋白。
join (2015-12-01 11:49:22)
请明确你的实验目的,是想进行基因克隆,还是检测表达,
如果是进行克隆,那么就应该是扩全长,若是检测就只要扩部分片段,
你的目的似乎是想扩出目的基因,所以应该是要扩全长。
步骤如下:
1。在genebank中搜到目的基因的全长mRNA序列;
2。确认目的片段的编码序列,也就是CDS;
3。根据CDS,在ATG及终止密码前后的序列来设计最佳引物;
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那么所谓的全长就是指cDS了???而并非指整个mRNA序列?
one (2015-12-01 11:49:40)
楼上的, cDS是编码区(coding sequence),不是指全长。
sunnyB (2015-12-01 11:50:00)
为什么同样是这样找,有的基因找不到啊?
大鼠的?
ALALA (2015-12-01 11:50:31)
但是还有一个地方不明白 求解答:设计引物时可以适当在ATG和TGA前后挪动,以获得最佳引物,但是余地不大。这个是什么意思~~
eor (2015-12-01 11:50:53)
想问一下 如果只是检测呢 而且也晓得基因序列 如何选择片段进行引物设计呢?
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