【求助】做荧光定量PCR扩增效率很低是为什么?

最新回复

• woshi (2015-12-04 09:21:02)

  
  太高了吧，我一般只加１ul模板和０.５ul的引物

• dotaaa (2015-12-04 09:21:30)

  
  模版有问题，建议你纯化一下模版。而且模版加的太多了。

• kuaizige (2015-12-04 09:21:47)

  
  可能是模版提取过程中残留的抑制PCR反应的物质在起作用，建议你把模版稀释几倍试试。引物量要适当，一般在0.1~0.2微摩。

• zhenxin (2015-12-04 09:22:07)

  
  可能一:模板浓度太高了.模板总量一般不超过100ng
  可能二:引物太多了,终浓度0.2uM就可以了,也就是10pmol/ul的引物只需0.5ul就可以了.

• yysr238 (2015-12-04 09:24:11)

  
  模板可能含有不纯杂质，会影响扩增效率。另外，你加的模板浓度也高了点，少加点。

• eor (2015-12-04 09:26:13)

  
  各位大侠：我在做PCR时也遇到扩增效率不高的问题，我的模板是从肠道内容物中用酚－氯仿提取法提取细菌的DNA，请问这种模板应该如何纯化处理呢？谢谢！

• whitesheep (2015-12-04 09:27:34)

  QUOTE:

  原帖由 eor 于 2015-12-4 09:26 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  各位大侠：我在做PCR时也遇到扩增效率不高的问题，我的模板是从肠道内容物中用酚－氯仿提取法提取细菌的DNA，请问这种模板应该如何纯化处理呢？谢谢！ ...

  建议用氯仿再抽提，不要加酚。

• dotaaa (2015-12-04 09:27:50)

  
  引物和探针100µM，各0.1µL就OK了Shy

• kuaizige (2015-12-04 09:28:50)

  
  模板是否太多不好说，因为不知你作反转录时tRNA用了多少，所以不大同意上面几位战友的意见，我在其他的试剂盒说明书里曾看到每２０体系里可以加入200ng tRNA，我认为扩增效率不高可能是因为你的tRNA提的不好，不知你目的基因的长度是多少，建议你重新提取RNA，再试试吧，这就是科学工作的意义。

• taoshengyijiu (2015-12-04 09:29:22)

  扩增曲线总是上不去,在一个较低的水平就到平台了,而且融解曲线的峰也很低,很少能上0.10以上.连内参GAPDH也是,怎么回事啊?
  25 ul 体系用了2ul的摸板和2l的引物,是不是太高了?
  
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  单独看楼主的叙述不好下确定的结论,但是有几点建议给你:
  1 在看溶解曲线说明你的显色系统是染料,那你首先要确定你扩出来的产物是不是你要的特异性条带,建议先不加染料,做定性跑胶看看,另外要仔细分析溶解曲线;
  2 扩增曲线只是平台低,那还可能是荧光信号显示或检测的效率问题,看看你染料的质量,仪器的保养等等,如果PCR扩增效率的问题,经常表现是Ct值也要靠后;
  3 至于体系配制,你没有给出浓度,实在无从谈起,但是开始做的时候,一般中规中矩就可以了.