【求助】两个OD的干粉状引物要怎么稀释备用啊？

最新回复

• xiaoxiaoniao (2015-12-04 11:22:17)

  先离心！然后加入适量的水或TE溶解。一般配制成较高浓度的母液（约100μM），保存于-20℃。使用前取出其中一部分用ddH2O配制成10μM或20μM的工作液。
  引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：一是容易形成引物二聚体（primer-dimer），二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。一般说来，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。一般终浓度用0.25-0.5pM/μl较好。

• fox_79 (2015-12-04 11:22:35)

  首先，强烈感谢主任的热情帮助，您总是最快的回复，最好的答案。
  另外，由于我是新手，想再请教主任几个比较菜的问题，还望您指导：
  1 引物的分子量如何计算？ 比如：AAGCTTTTACCGC的分子量是多少？
  2 OD值  ，1个OD值是不是等于40UG。
  3 质量数，质量数的含义是什么，怎么计算？
  4摩尔数（μmol）和终浓度(pM)和稀释水量（μl）  
  是不是计算稀释引物都要用到以上四点的各个参数？具体的公式是什么呢？
  向您再次致谢！谢谢！

• xiaoxiaoniao (2015-12-04 11:22:52)

  合成引物的单子上应该有算法：
  1OD=33ug
  1个碱基的分子量=324.5
  （以上为近似值，通常都这样用）
  1条引物的分子量=碱基数*324.5
  质量数=OD*33ug
  摩尔数=质量数/分子量

• hyuu (2015-12-04 11:23:12)

  我补充问一点，先离心的原因是什么？
  直接把算好的ddH2O加进去颠倒混匀后不是效果一样么？
  另外，我们实验室的好象都习惯在静置4度过夜，这样引物分子能更好的扩散，均匀分布于液体中，个人认为这样也是很有道理的

• xiaoxiaoniao (2015-12-04 11:23:42)

  
  因为引物合成后是干粉状的，在运输过程中可能会沾到管壁或管盖上，直接打开有些粉末可能会飘出去，引物的量就减少了。先离心使粉末都到管底，可以避免这种现象的发生。4度过夜也可以，不过一般室温10分钟，吹打混匀即可。

• moonlight (2015-12-04 11:23:56)

  
  先离心,以防打开后粉末飘散出去。然后根据以下公式可计算出所加双蒸水的量
  33nmol/OD×管上所标OD值×100
  是为10pmol/ul浓度的引物溶液,还可以由此推算其它浓度所需的双蒸水量。
  可于－20度保存。

• vvmmoy (2015-12-04 11:24:16)

  订引物回来的说明书背面一般都有引物稀释计算的说明的.

• vera+ (2015-12-04 11:24:32)

  先离心,以防打开后粉末飘散出去。然后根据以下公式可计算出所加双蒸水的量
  33nmol/OD×管上所标OD值×100
  是为10pmol/ul浓度的引物溶液,还可以由此推算其它浓度所需的双蒸水量。
  可于－20度保存。
  计算结果单位不对呀。是估算值吗？

• xevin (2015-12-04 11:24:51)

  QUOTE:

  原帖由 vera+ 于 2015-12-4 11:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  先离心,以防打开后粉末飘散出去。然后根据以下公式可计算出所加双蒸水的量
  33nmol/OD×管上所标OD值×100
  是为10pmol/ul浓度的引物溶液,还可以由此推算其它浓度所需的双蒸水量。
  可于－20度保存。
  计算结果单位不对呀 ...

  给你提供一下我们的计算方法，引物浓度50uM，需加ddH2O的计算公式：
  OD值×33ug×1000000/（50uM×引物分子量），算出的ddH2O体积单位为ul

• Darcy (2015-12-04 11:25:07)

  
  33乘以OD数再除以分子量再乘以1000即是所需ddH2O的微升数 浓度：10nM。

• bling (2015-12-04 11:25:21)

  
  100pmol比较好吧？注意保存多份 防止污染 啊

• bling (2015-12-04 11:25:48)

  
  最好用DEPC水,用ddH2O有可能被污染,尤其是做RT-PCR!

• eor (2015-12-04 11:26:12)

  
  我提供一个引物稀释专用Excel计算表（也可用于建立自己的引物数据库），应用方式为纯“傻瓜式”，填好数据后，一拉填充柄即可；一点不懂Excel的就不要下载了Smile

• vvmmoy (2015-12-04 11:26:33)

  根据你需要的浓度，假如你需要终浓度为64PM，那么你用的DEPC水(RNA),或双蒸水（DNA)的量为33xOD值/64x分子量 ，然后乘以10的六次访，就是你要加入的水的微升数！

• Darcy (2015-12-04 11:26:49)

  
  所用的引物最好用灭菌的超纯水稀释，-20度保存，你可以买那些通过减压干燥的引物，最大的优点在于引物以薄膜状紧贴在管底，无需用前离心，很方便。

• 蒲公英 (2015-12-04 11:27:07)

  引物从公司回来后我们实验室的一般步骤是：
  可先暂放4度冰箱,后稀释成贮存液、工作液。
  贮存液——100pmol/ul；工作液10pmol/ul。
  具体做法如下：
  1、取出引物，5000rmp/min，离心3min。
  2、小心开启离心管，加入Zul灭菌超纯水，涡旋使其溶解，浓度为100pmol/ul
  Z=10000*OD数*33/引物分子量
  -20度冰箱贮存。
  3、取20ul的100pmol/ul贮存液，加180ul灭菌超纯水，稀释成10pmol/ul，4度冰箱备用。

• ALALA (2015-12-04 11:27:28)

  
  请问引物的工作液（10uM）可以在四度放多长时间？

• gogo (2015-12-04 11:28:06)

  
  最多几个月！