我也是新手,刚做RT-PCR。目的基因、β-actin都没做出来。我用oligo分析了一下你的引物,其它的都很好。就是Analyze》PCR的时候提示“Excessive difference between product and primer melting temperatures.”,Help里面提到 产物引物Tm差值不要太大,会导致模板-模板、引物-模板之间退火发生竞争。当上下游引物浓度各为200nM时,Tm差值为28.4【一般不要超过20】。当上下游引物浓度都提高到1uM时,Tm差值为25.4。所以我觉得是你的引物问题。另外不知道你用的引物终浓度是多少?
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ns5fan (2015-12-04 15:57:45)
你的上游引物GC含量为40%,下游为61%。一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。但有时虽然这样,也可出来结果,我觉得还要先看看你的体系是否有问题,beta-actin已经出来了么?如果没有问题,在低于引物合成公司提供的TM值4度,试试!
seagate (2015-12-04 15:59:35)
经OLIGO评价:你的上下游引物的各项指标都还不错,应该不是引物的问题,你可以从其他方面考虑一下:
1、在你所用实验组织或细胞中有没有这个基因的表达?
2、所提RNA的质量如何?是否尽量避免了RNA酶的污染?
3、内参能否做出来?如果内参能做出来,说明体系没问题。
4、反转录酶是否有效。
5、PCR的退火温度在60℃上下试试。
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ero11 (2015-12-04 16:00:56)
vvmmoy (2015-12-04 16:01:14)
mogu (2015-12-04 16:01:55)
我是把查到的基因CDS序列放到word文档中,先用查找替换,把其中的数字和空格都去掉,成为连续的碱基符号队列。然后再在这个连续的碱基符号队列中查找你的引物,其中上游引物直接查找,下游引物反向互补后再查找,查找完毕用word中的字数统计就可以知道你的引物所在的位置了,进而可以在软件中进行分析。
这个办法比较笨,但是因为没人指导,目前位置我就摸索出这么一种方法,操作起来也不是太麻烦,你可以在高手指导前先试试Smile
直接输入引物序列的分析方法我还没有用过,期待楼上站友能传道授业解惑,我和楼上就一起受益了。
yonger (2015-12-04 16:02:13)
seagate (2015-12-04 16:02:33)
白白的 (2015-12-04 16:03:09)
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我也是新手,刚做RT-PCR。目的基因、β-actin都没做出来。我用oligo分析了一下你的引物,其它的都很好。就是Analyze》PCR的时候提示“Excessive difference between product and primer melting temperatures.”,Help里面提到 产物引物Tm差值不要太大,会导致模板-模板、引物-模板之间退火发生竞争。当上下游引物浓度各为200nM时,Tm差值为28.4【一般不要超过20】。当上下游引物浓度都提高到1uM时,Tm差值为25.4。所以我觉得是你的引物问题。另外不知道你用的引物终浓度是多少?
mogu (2015-12-04 16:03:28)
mogu (2015-12-04 16:04:37)
mogu (2015-12-04 16:05:02)
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summerxx (2015-12-04 16:05:17)
seagate (2015-12-04 16:05:42)
我也是新手,自己PCR也没做好。自己也只是在空谈理论。我觉得看提高引物浓度到1uM能不能把产物引物之间的Tm值降低到20以下,如果可以那就不用。如果不行,那就要换。
仅供参考!
okhaha (2015-12-04 16:05:56)
greenbee (2015-12-04 16:06:16)
楼上P不出来的朋友:是不是用了生工的引物?我们已经被生工的引物害苦了!
ending (2015-12-04 16:06:34)
我用的生工的引物,没P出来,郁闷了好久了,请问楼上的"融合素"你们的引物合成有什么问题啊?
【求助】引物验证