【求助】PCR结果分析

最新回复

• 969 (2016-1-07 16:35:07)

  
  第二张图是我做50-60度温度梯度的PCR结果，上样量为8ul（以前用5ul没有跑出条带，所以增加上样量）这张是以前跑的加5ul PCR产物的上样量

  
  78372257.jpg

• 969 (2016-1-07 16:37:51)

  
  第二张图是没有加marker的，因此就用同一次的PCR产物5ul上样，跑出的结果图，忘记说了，我的PCR产物应该是130bp的，marker最小是150bp

  
  93035341.jpg

• Darcy (2016-1-07 16:38:39)

  
  看第二张图，你的电泳没加MARKER，虽说在最小的地方有条带，也不能说就是你130bp的目的条带（你的目的条带太小），不过我看着应该是引物二聚体。

• 969 (2016-1-07 16:41:07)

  QUOTE:

  原帖由 Darcy 于 2016-1-7 16:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  看第二张图，你的电泳没加MARKER，虽说在最小的地方有条带，也不能说就是你130bp的目的条带（你的目的条带太小），不过我看着应该是引物二聚体。

  第四张图用的PCR产物跟第二张图用的PCR产物是同一次扩增的产物，第四张图跟了marker的，可以看到模糊的条带，很宽很弥散，并且位于marker的最低位置（150bp）和marker的第二个条带（300bp）之间。如果是引物二聚体的话，是不是应该没有这么大吧？

• loli (2016-1-07 16:41:23)

  
  你的marker怎么这么模糊，能拍的更清楚些么，marker的亮度应该跟你第一张图片的亮度差不多才对吧

• guagua (2016-1-07 16:41:47)

  第四张图用的PCR产物跟第二张图用的PCR产物是同一次扩增的产物，第四张图跟了marker的，可以看到模糊的条带，很宽很弥散，并且位于marker的最低位置（150bp）和marker的第二个条带（300bp）之间。如果是引物二聚体的话，是不是应该没有这么大吧？
  
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  哦，第四张图上除了Marker还有带吗？原来没看出来！你的目的条带是130bp，引物二聚体一般出现在泳道的最前端，那就是杂带。建议你优化下引物用量或者PCR条件试试！

• 969 (2016-1-07 16:43:37)

  QUOTE:

  原帖由 guagua 于 2016-1-7 16:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  第四张图用的PCR产物跟第二张图用的PCR产物是同一次扩增的产物，第四张图跟了marker的，可以看到模糊的条带，很宽很弥散，并且位于marker的最低位置（150bp）和marker的第二个条带（300bp）之间。如果是引物二聚体的话，是不是应该没有 ...

  那我想知道杂带是怎么形成的呢？只听过引物二聚体和非特异性产物。

• glass (2016-1-07 16:43:58)

  QUOTE:

  原帖由 969 于 2016-1-7 16:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  那我想知道杂带是怎么形成的呢？只听过引物二聚体和非特异性产物。

  我说的杂带就是PCR非特异性产物！
  形成原因主要有：第一，引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。第二，Mg2+浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。第三，酶的质量，往往一些酶较容易出现非特异性扩增，酶量过多时也会出现非特异性扩增。
  其对策有：1、必要时重新设计引物2、减少酶量或调换另一种酶3、降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。4、适当提高退火温度或采用二步PCR法（93度变性，65度退火与延伸）。
  看看的的PCR条件，多试几次，希望能解决你的问题！

• 969 (2016-1-07 16:45:19)

  QUOTE:

  原帖由 glass 于 2016-1-7 16:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  我说的杂带就是PCR非特异性产物！
  形成原因主要有：第一，引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。第二，Mg2+浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。第三，酶的质量，往往一些酶较容易出现非特异性扩增，酶量过多 ...

  哈谢谢你们热情的给我指点迷津，真的非常感谢！我重新订了引物，引物用BLAST搜出来的结果是：特异性较差！

• 969 (2016-1-07 16:45:56)

  QUOTE:

  原帖由 loli 于 2016-1-7 16:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  你的marker怎么这么模糊，能拍的更清楚些么，marker的亮度应该跟你第一张图片的亮度差不多才对吧

  哈我的Marker是不怎么清楚，我想问问你们平时做PCR跑胶的时候，goldview 是什么时候加的，就是说是在琼脂糖溶了并且温度很高的时候加入，还是在等琼脂糖溶了并冷却了以后再加入goldview。我们是前一种方法。

• glass (2016-1-07 16:46:17)

  QUOTE:

  原帖由 969 于 2016-1-7 16:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  哈我的Marker是不怎么清楚，我想问问你们平时做PCR跑胶的时候，goldview 是什么时候加的，就是说是在琼脂糖溶了并且温度很高的时候加入，还是在等琼脂糖溶了并冷却了以后再加入goldview。我们是前一种方法。 ...

  我们是在琼脂糖融了之后，等冷却到微烫时加入goldview， 不过我查了goldview的使用说明书，没发现有这方面的说明。有些实验室甚至用加过goldview的凝胶反复融化使用，所以我认为至于什么时候加入关系不大。

• zhenxin (2016-1-07 16:46:32)

  
  因为你的pcr产物分子量较小，所以跑pcr时候，胶的浓度最好高一些，2-3%吧，你试一下。

• 969 (2016-1-07 16:47:18)

  QUOTE:

  原帖由 zhenxin 于 2016-1-7 16:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  因为你的pcr产物分子量较小，所以跑pcr时候，胶的浓度最好高一些，2-3%吧，你试一下。

  我也考虑过这个问题，但我同学的是81bp的，她的就可以跑出来，我的是130bp,应该也没有什么大的问题吧！不过下次我会试一下你的建议哈，谢谢！！