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【求助】这是我提取的RNA电泳图,新手请教问题
【求助】这是我提取的RNA电泳图,新手请教问题
这是我提取的新鲜组织RNA电泳图,请问是否降解的严重?但是我测得紫外分光光度计值分别是1.699、1.79、1.834,能否用来RT?
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字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2016-1-08 10:41 作者: 北风那个吹 来源: 分析测试百科网
最新回复
北风那个吹 (2016-1-08 10:43:01)
北风那个吹 (2016-1-08 10:43:25)
怎么没有人回答呢,是不是问题太简单了?
又提了一次,觉得RNA跑电泳就是没有漂亮的条带,降解严重,但是紫外分光光度计值又都在1.7-2.0之间,为什么呢?
北风那个吹 (2016-1-08 10:44:44)
本着试试的态度,拿先前的RNA跑了RT-PCR后,发觉内参出来了,目的条带似有似无的样子,不知道是不是,因为第一次做,总觉得自己做的有问题。
北风那个吹 (2016-1-08 10:45:04)
又拿第二次提的组织跑了一次RT-PCR,退火温度降了,结果还不如第一次的,条带更弱了些,还出现引物二聚体,问什么?实验的事情好头痛。
cocacola (2016-1-08 10:45:56)
1.从少量样品(1-10mg组织或102-104细胞)中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800ml TRIzol匀浆样品,沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来,糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成,也不影响PCR反应。
2.匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。
3.分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机,2600×g离心30-60分钟。
预期产量:1mg组织或1×106细胞提取RNA分别为:
肝和脾6-10μg ,肾3-4μg ,骨骼肌和脑组织1-1.5μg ,胎盘1-4μg ,上皮细胞8-15μg ,成纤维细胞5-7μg 。
常见问题分析:
得率低:A.样品裂解或匀浆处理不彻底
B.RNA沉淀未完全溶解
A260/A280<1.65 :A.检测吸光度时,RNA样品没有溶于水,而溶于了TE中。低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高
B.样品匀浆时加的试剂量太少
C.匀浆样品时未在室温放置5分钟
D.吸取水相时混入了有机相
E.RNA沉淀未完全溶解。
RNA降解:A.组织取出后没有马上处理或冷冻
B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃
C.细胞在用胰酶处理时过度
D.溶液或离心管未经RNase去除处理
E.电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5
DNA污染: A. 样品匀浆时加的试剂量太少
B.样品中含有有机溶剂(如乙醇,DMSO等),强缓冲液或碱性溶液
蛋白聚糖和多糖污染: 沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染,步骤7中,每使用1ml TRIzol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(0.8M柠檬酸钠和1.2M NaCl)混合离心,按之前操作进行。这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中,高效沉淀出纯RNA。从含有大量多糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心,并加上以上操作步骤。
xuuuu (2016-1-08 10:46:10)
北风那个吹 (2016-1-08 10:46:28)
附图左边是第一次pcr,右边是第二次PCR,目的条带较弱,还有一条非特异性的带跟着
北风那个吹 (2016-1-08 10:47:47)
我敢着提RNA,怕组织冻存的太久已经降解了,发觉提的越来越差。都找不出原因,分光光度计测值测得都离谱了。
finger (2016-1-08 10:48:02)
OD值是用来检测样品纯度的,而电泳是检测样品的完整性。一个好的样本,这两个指标应都处于最佳状态。但根据实验的要求而异,如果是扩增小片断,完整性的要求不是很高,你的降解程度也可用于后续试验,如果是大片断,那就要重新提取了,看是哪一部分降解了。
北风那个吹 (2016-1-08 10:48:19)
【求助】这是我提取的RNA电泳图,新手请教问题