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【求助】请赐教做SOE-PCR的一些经验
【求助】请赐教做SOE-PCR的一些经验
我这段时间正在做SOE-PCR反应，要将900bp和750bp的两个片段拼接到一起，做了几次，结果总是两个片段连不到一起，跑电泳仍然是之前的两条条带，
有点摸不到头绪，不知是哪里出了问题，我用的是TAKARA的Ex Taq酶，反应体系（50ul体系）及条件如下，请各位高手帮我看看该如何调整，赐教一些做SOE-PCR反应的经验。谢谢！
Buffer 5ul ，Mgcl 4ul ，dNTP 5ul ，Ex Taq 0.25ul（1.25U），两个片段DNA各 1ng，94度预变性5min，然后94度30s，55度30s，72度1min，7个循环，加引物各2ul（10pmol/ul），Ex Taq 0.25ul，94度预变性5min，之后94度30s，57度30s，72度1min30s，30cycles，72度10min
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eor (2016-1-08 11:10:03)
重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR)由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来.此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组,而且不需要内切酶消化和连接酶处理,可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物.重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计.重叠延伸PCR在基因的定点突变、融合基因的构建、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有其广泛而独特的应用。
以下是重叠延伸PCR的原理及两基因的引物设计：
A基因：
上游（F1）与开放阅读框起始密码子附近的序列相对应，并在5 ’末端添加酶切位点和3个保护碱基；下游（R1）与B基因终止密码子附近的序列及A基因5’末端起始密码子附近的序列互补，并去除A基因的终止密码子TAA
B基因：
上游（F2）与A基因终止密码子附近的序列及B基因5 ’端起始密码子附近的序列相对应，同样去除A基因终止密码子TAA；下游（R2）与B基因的开放阅读框终止密码子序列互补，并在5’末端添加酶切位点和2个保护碱基。
先分别用F1、R1，F2、R2扩增出A和B基因，然后再用F1和R2将两基因连接起来，得到融合基因。
重叠延伸PCR技术关键是：1。引物设计质量要过关；2。各个TM要一致,不可差别太大.
70298390.jpg
49888 (2016-1-08 11:10:50)
昨天我将两个基因片段的量提高到1ng（100ul体系），同时相应提高外侧两条引物的量，电泳结果在2000bp之前的位置得到了目的条带，但是很淡，而且条带拖尾很明显，奇怪的是，在2000bp之后也有一条宽亮度与目的条带很相似的条带，请问各位高手是否遇到过这种情况？条带拖尾严重是不是可以通过提高退火温度来解决？怎样可以使目的条带更清楚些？谢谢！！！
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一年前做过SOE-PCR，效果不错，但是期间也遇到许多挫折，愿与大家分享解决方案：
做SOE遇到的第一个重大问题就是这个拖尾，经过阴性和阳性验证无体系污染和DNA聚合酶问题，后来运用降落PCR得以解决，效果很不错，拖尾明显减弱，条带亮度和特异性明显增强，因此，你可以用高于Tm值5-10度先进行10个循环，然后再用比较低的退火温度如55度或者Tm-10度来进行30-35个循环，可以试试看啊，说不定会有很意想不到的效果！
2.其次就是SOE引物设计的问题，我在设计引物之初不敢下手，可是实在没有人愿意帮忙设计，只好自己整，没想到居然效果都还不错，虽然后面的重叠延伸遇到非特异性拖尾，但是还是能够解决的，所以感觉引物设计基本还是成功的，后来又设计过几次，每次都能做出满意的结果，所以请那些想用SOE但是不敢下手设计引物的兄弟姐妹放手去设计，没有什么高难度的，但是以下几点需要注意：
（1）如果是用的PP5，一定要保证不能有False Priming；
（2）不要怕设计长引物，我设计过的最长引物为～60mer，只要保证足够长的重叠区段和足够效力的引发区段即可（我一般重叠区设计15-25mer，引发区设计13-18mer）；
（3）注意引物Tm值的平衡，一般控制在5度以内；
（4）如果是用于突变，一定要将突变位点设计在引物的中段近5'端，才能保证突变的有效性。
3. 第一步的两个模板需要切胶回收纯化，虽然有损失，但是绝对有利于下一步重叠延伸，如果是突变引物，则需要先进行无引物的PCR反应5-10个循环，以保证突变体的形成，然后加入上下游引物完成整个PCR反应。
以上是我做了快一年，大约5次SOE-PCR实验的经验，与大家分享，希望批评指正！
xuuuu (2016-1-08 11:11:05)
重叠延伸PCR引物的设计是关键，扩增出A/B片段后，可在不加引物的条件下扩增10个循环，退火温度、时间等视具体引物及基因片段的不同而不同，然后再加入引物（上F1、下R2）进行扩增
rfv (2016-1-08 11:11:25)
学习并尝试回答：
先在园子里搜一下，有一些介绍：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=1240902&sty=3&keywords=SOE-PCR')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/3761538_1.html')
所谓SOE-PCR：就是Splicing by Overlapping Extension PCR 的缩写。
现在一整一个缩写吓唬人，我还以为是什么新技术，原来是经常使用的叠加PCR，个人认为这个技术主要应用在这几方面
1。基因合成
2。多点突变
3。从基因组中获取内含子连续序列（这好像也有一个名词，忘了）
4。其它，包括像加进去一段序列什么的
注意的事项：
1。因为应用原因，一般都使用高保真酶。
2。一般两个序列间能搭上20bp救行。
分析一下楼住可能出现的问题：还能出现两条带这是不正常的，所以很可能把四条引物都加进去了。做SOE-PCR应该只加最外侧的两条引物，我觉得这应该是常识。如果不是这个原因，那就重新审核一下你的方案吧，引物的设计有没有错，可能的失误是搭上的引物一样而不能退火。
供参考。
eor (2016-1-08 11:11:52)
以下是重叠延伸PCR的原理及两基因的引物设计：
A基因：
上游（F1）与开放阅读框起始密码子附近的序列相对应，并在5 ’末端添加酶切位点和3个保护碱基；下游（R1）与B基因终止密码子附近的序列及A基因5’末端起始密码子附近的序列互补，并去除A基因的终止密码子TAA
B基因：
上游（F2）与A基因终止密码子附近的序列及B基因5 ’端起始密码子附近的序列相对应，同样去除A基因终止密码子TAA；下游（R2）与B基因的开放阅读框终止密码子序列互补，并在5’末端添加酶切位点和2个保护碱基。
先分别用F1、R1，F2、R2扩增出A和B基因，然后再用F1和R2将两基因连接起来，得到融合基因。
重叠延伸PCR技术关键是：1。引物设计质量要过关；2。各个TM要一致,不可差别太大.
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yes4 (2016-1-08 11:12:09)
多谢各位高手赐教！！！本人不胜感激。
昨天我将两个基因片段的量提高到1ng（100ul体系），同时相应提高外侧两条引物的量，电泳结果在2000bp之前的位置得到了目的条带，但是很淡，而且条带拖尾很明显，奇怪的是，在2000bp之后也有一条宽亮度与目的条带很相似的条带，请问各位高手是否遇到过这种情况？条带拖尾严重是不是可以通过提高退火温度来解决？怎样可以使目的条带更清楚些？谢谢！！！
whitesheep (2016-1-08 11:12:29)
ladyhuahua (2016-1-08 11:12:48)
如果两个片段间末端没有重叠区的话，不加引物延伸也没有用的！有重叠区，变性后双链打开，退火的时候一个片段有部分单链会跟另一个片段单链的重叠区退火，相当于加了一对反向的重叠引物，在聚合酶作用下扩增，就得到了部分你所需要的长片段，再加入引物扩增，就可以获得你所需要量的长片段产物！
若不加引物延伸，温度当然也是72，时间根据你的片段长度和聚合酶的种类来确定！EXtaq应该是1min/kb，你相当与扩增了900bp（最长片段），1min就够了！！
33号 (2016-1-08 11:13:04)
二年前作过SOE-PCR,也碰过壁,还好结果理想,现将其
经验总结如下:
1.SOE-PCR有人称为"搭桥PCR",所有问题的关键是引物的设计.
各条引物间Tm数值比一般的PCR 要求严格,最好差1度内
2.重叠引物最好在18bp以上有助于退火温度相差不大
3.PFU酶活性要高,若没有PFU酶可用其他酶,片段再平端华
misswu61 (2016-1-08 11:13:19)
重叠延伸PCR引物的设计是关键，扩增出A/B片段后，可在不加引物的条件下扩增10个循环，退火温度、时间等视具体引物及基因片段的不同而不同，然后再加入引物（上F1、下R2）进行扩增
bojitu (2016-1-08 11:13:34)
caihong (2016-1-08 11:32:48)
jkobn (2016-1-08 11:33:06)
我想应该是这个意思，也就是模板上的序列。
lorri (2016-1-08 11:33:24)
两个片段DNA各 1ng ,可能不够.
lorri (2016-1-08 11:35:31)
如果用Taq酶，重叠区域必须选择左T右A的区域序列,这是什么原因,请高手指教,\?
源于
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/3761538_1.html')
3.14 (2016-1-08 11:35:52)
7年后复习这个帖子，发表一下自己的见解，以助于以后观帖的战友。我觉得lz不应该用宝生物的Ex Taq，因为这个酶可以在3'段加A，做SOE PCR所以的聚合酶一定不可以具有催化PCR产物末端加A的作用！（刘森，2009，PCR 聚合酶链反应，134）
PINK (2016-1-08 11:36:13)
昨天我将两个基因片段的量提高到1ng（100ul体系），同时相应提高外侧两条引物的量，电泳结果在2000bp之前的位置得到了目的条带，但是很淡，而且条带拖尾很明显，奇怪的是，在2000bp之后也有一条宽亮度与目的条带很相似的条带，请问各位高手是否遇到过这种情况？条带拖尾严重是不是可以通过提高退火温度来解决？怎样可以使目的条带更清楚些？谢谢！！！
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我现在在做重组PCR，也遇到了你说的问题，请问你是如何解决的？
【求助】请赐教做SOE-PCR的一些经验