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【求助】RNA提取后有必要用DNA酶处理吗?
我在RT-PCR实验中提取RNA后,发现一些不该出现强表达的基因,最后PCR产物也有很多。我有些怀疑是否是RNA提取过程中混有DNA。请问RNA混有DNA会出现靶基因PCR产物增多的现象吗?您平时实验中RNA提取后是否常规用DNA酶处理呢?【求助】RNA提取后有必要用DNA酶处理吗?
此外RNA产物用DNA酶处理有没有什么好的方案?按照Promega的方案加DNA酶工作液后会造成离子浓度的变化,RNA须重新抽提。即麻烦,又可能损失RNA。不加工作液,DNA酶效率又不高。我看见有的文章就单加高浓度的DNA酶。
还有一个问题:我提取的胰腺组织RNA降解得非常厉害,RNA电泳一片模糊。别的组织则无问题。我都是按照TRIZOL说明书操作的,请问您有什么好建议吗?
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【求助】RNA提取后有必要用DNA酶处理吗?
最新回复
ns5fan (2016-2-05 17:14:23)
btw: OD260/280<1.6 不能作为是否弃用RNA的指标。由于各地水质的不同在这方面会有差别。我们这以前用millipore纯化系统的得到的水(应该说是很好的)来溶解RNA,但有时OD也会到1.5-1.6之间,现在都是用sigma的水来溶解RNA,在 OD260/280上没出过问题。
eor (2016-2-05 17:14:39)
yhn (2016-2-05 17:14:55)
引物跨内含子的说。
applebook=213 (2016-2-05 17:15:13)
大鼠放血处死后立即取胰腺和肺组织约50mg,迅速浸入液氮速冻,-70oC保存。
总RNA提取按照说明书所述方法并略做改动如下:取出冻存样本50mg,迅速转入预冷的研钵中,加入液氮,于研钵中研细。加入0.5mL Trizol继续研磨并与组织充分混合。将匀浆液转入1.5mL离心管中,-70oC保存待处理。
1) 将Trizol匀浆液解冻,4oC,12000g离心10分钟
2) 吸取上清液至另一离心管,15-30oC,放置5分钟
3) 加入氯仿0.1mL(1/5Trizol量),震荡15秒,15-30oC,放置10分钟。4oC,12000g离心15分钟
4) 吸取2/3上清,转至另一离心管
5) 加异丙醇0.25mL(1/3-1/2 Trizol量)沉淀RNA,轻轻颠倒混匀,15-30oC,放置10分钟。4oC,12000g离心10分钟
6) 弃上清,缓慢沿壁加75%乙醇700ul,轻轻颠倒洗管壁,小心弃乙醇
7) 重复清洗一次
8) 移液枪吸去所有上清,干燥沉淀5分钟
9) 加入20-50ul Rnase-free的蒸馏水完全溶解RNA沉淀,-70oC保存。
取2ul RNA溶液经2%琼脂糖凝胶电泳,鉴定RNA质量。取1ul RNA溶液100倍稀释,用核酸蛋白检测仪进行分析、定量。OD260/280<1.6者弃用,计算标本RNA浓度。
xiaoxiaoniao (2016-2-05 17:15:27)
楼主所做的是动物方面的,我们实验室都是做植物的。现在也出现与你相似的问题。我们用不同的植物材料提取总RNA,电泳后都没有明显的DNA污染,之后反转录,用简并引物扩增同一基因片段。有两种植物扩出该基因,同源性很高,但另一植物中扩出的片段较大,测序之后找到了引物序列,但BLAST之后发现与要扩的基因没有任何相关,而且多与基因组序列同源!
现在我们怀疑PCR扩增时是以RNA中的DNA为模板的,而不是以反转录得到的cDNA为模板的。
以前连续提过数次该植物的RNA,但是每次都会有部分DNA,这次的DNA是最少的。所以重提似乎并不是最好的办法,但用DNAase消化又存在问题。再往下做有点困难了。
另外,如piscean所说,若引物跨内含子的话,以cDNA为模板的扩增效率应该比较低吧?可是连续几次都扩出来了,而且测序结果似乎含有内含子。这种情况怎么解释呢?
希望诸位多多赐教,好指导我们实验的顺利进行,谢谢!
ns5fan (2016-2-05 17:15:51)
RNA提取后有没有必要用DNA酶处理主要和你的用途有关。如果仅仅是扩某个基因,那就无所谓。如果是定量RT-PCR,则最好DNA酶处理一下,或者引物需跨exon. 我们这是用QIAGEN的RNase-free的DNase处理的,不是加了DNase就结束了,为了去除DNase(蛋白)和buffer等可能影响到后期操作的因素,所以酶解了DNA后必须纯化RNA(QIAGEN的纯化柱),这样得到的RNA我们才用于定量实验。即使这样,我们在做real-time PCR时都要加一管仅加RNA的作为阴性对照(排除DNA的污染)。
btw: OD260/280<1.6 不能作为是否弃用RNA的指标。由于各地水质的不同在这方面会有差别。我们这以前用millipore纯化系统的得到的水(应该说是很好的)来溶解RNA,但有时OD也会到1.5-1.6之间,现在都是用sigma的水来溶解RNA,在 OD260/280上没出过问题。
ero11 (2016-2-05 17:16:12)
好象我们实验室以前有个师兄做的RT-PCR产物中就含有内含子,就是说他刚好把那个还没剪切好的mRNA给反转录过来了,所以含有内含子,不过这样的几率应该比较小的。我总觉得我以前的那个师兄特别倒霉。
duchy (2016-2-05 17:16:31)
duchy (2016-2-05 17:18:16)
补充一下:我的总RNAOD260/280为1.7,希望大家多多指教!
applebook=213 (2016-2-05 17:18:33)
顺便请教一个问题:如何从电泳中看出有DNA污染?我检验RNA用的是普通电泳(我们都这么干),出来的条带有三条主要的,相对位置也与28s,18s,5s很象。但让我有些疑惑的是条带非常细(整齐,不弥散),倒是比公司宣传册上的还要整齐。而且整个条带之间还可看见一些细小的梯状带。而在胰腺组织提出的RNA往往是模糊一片,提示降解很厉害。哪位战友有经验,帮我诊断一下这种带型正不正常?谢谢!
【求助】RNA提取后有必要用DNA酶处理吗?