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【求助】给本科的同学们分享一下我对RNA提取过程的总结哦

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2016-2-09 22:28    作者: PCR    来源: 分析测试百科网

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【求助】给本科的同学们分享一下我对RNA提取过程的总结哦
无聊中。。。没啥事情做的，就把自个儿实验的心得加上书上的步骤稍作整理，写一点点小文，赚一点点分数，嘿嘿。。。
特点：RNA不稳定，易降解。
由于核糖残基的2'和3‘位置带有-OH，RNA易于被RNase切割水解。
RNase含量丰富，加热后仍然能够正确折叠，恢复活性，难以失活。
注意事项：1、经常更换新手套，因为皮肤和实验用品上可能有RNase，会导致RNase污染，使用灭菌后的塑料制品和墙头避免交叉污染。
2、应该使用不含RNase的塑料和玻璃器皿，玻璃器皿可以在150度烘烤4小时，塑料器皿可以在0.5MNaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可除去RNase。
3、常用RNA酶抑制剂，DEPC。
步骤：
1、材料裂解。
2、杂质的去除。
3、RNA吸附或沉淀。
A、裂解：异硫氰酸呱，巯基乙醇等，使核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制RNase。
B、去处杂质：苯酚，氯仿，异戊醇抽提去除杂质，使得RNA及蛋白沉淀到有机相
C、研磨材料吸附，或用异丙醇沉淀浓缩RNA。
以经过DEPC处理的水溶液溶解RNA。
材料准备及裂解：
尽量使用新鲜材料，植物组织选取杂质少，生长较快的幼嫩部位，现取现提。组培细胞和血液应该尽量离心去除培养液和上清液，消化系统的组织选取杂质少的部位，细菌和酵母需要匀浆处理。
对不能马上提取的样品切成小块后立即投入液N2冷冻，或者投入专门的样品储存液中保存。
未完待续
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  • PCR (2016-2-09 22:28:46)


    液N2研磨时不要使液N2挥发净，随时补充，加入裂解液并且彻底而迅速地匀浆。
    RNA的提取
    杂质的抽提
    采用有机（酚\氯仿）抽提时应充分混匀。
    离心分离两相时，应保持一定的转速和时间，使蛋白质和DNA分布到中间层和有机相中，RNA留在水相中。
    对脂肪含量较多的样品注意不要吸入油脂层，可以再次用有机溶剂抽提。
    RNA的沉淀和溶解
    含有RNA的水相过吸附柱，通过去蛋白液和漂洗液去除蛋白和多糖等杂质。
    或使用异丙醇沉淀RNA应充分地混匀并放置10min左右离心收集沉淀。70%酒精洗涤，晾干。用经过DEPC处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解RNA。
    样品收集后或需长期保存时应置于-70摄氏度或加入RNase抑制剂，分装使用。
    RNA的检测
    电泳槽系统的处理，乙二醛化琼脂糖凝胶电泳，含有甲醛的琼脂糖凝胶电泳
    RNA纯度及浓度的检测
    A260=1 约40微克/mlRNA
    A260/280约为1.9-2.1
    RNA提取常见问题
    1、抽提过程不彻底，存在蛋白质或者多糖多酚的污染
    2、DNA污染
    3、离子浓度较高
    原因对策
    1、保证彻底地裂解和一定转数一定时间的离心，增加有机溶剂抽提的次数，用吸附柱纯化。
    2、减少处理样品的量，加入不含RNase的DNase处理，再次纯化。
    3、增加漂洗次数。
    RNA提取常见问题
    问题一、RNA样品不纯
    1、样品含有杂质杂液。
    2、样品过量或者样品裂解，和匀浆不彻底。
    3、RNA未有效地吸附沉淀和洗脱。
    4、样品RNA含量少。
    原因对策
    1、去除样品中的杂质，离心除尽样品中的培养基或储存液。
    2、减少样品用量，充分研磨样品，增加裂解液的用量和裂解的时间。
    3、延长吸附时间或者保证异丙醇沉淀的时间和离心时间，再次洗脱。
    4、重复吸附，加入肝糖等有助于RNA沉淀的试剂。
    问题二、RNA得率低
    1、样品不新鲜或样品保存不当，RNA降解。
    2、污染了RNase。
    3、样品储存不当。
    原因对策
    1、尽量取新鲜样品，取样后立即放入液N2保存，或者放入专门的储存液内。研磨样品要及时补充液N2。
    2、认真地处理相应的器具和试剂，严格按要求操作。
    3、-70摄氏度冻存，分装使用，加入RNase抑制剂。

  • ladyhuahua (2016-2-09 22:29:08)


    楼主不是医学生能分析这些东东，那就是公司复杂实验方面的啦？

  • greenbee (2016-2-09 22:29:28)


    请问LZ用什么裂解液？
    我们用的是Trizol，而有的Trizol试剂说明书写这样抽提的RNA的 A260/A280值在1.6-1.8之间，比值大于1.8我们一般考虑为基因组DNA 的污染。我最近一直在做Realtime PCR，用的模板就是通过抽提细胞的RNA经逆转录所得，每次测RNA的纯度（比值）都是1.7-1.8，后续实验的结果也不错。就是很少能把比值做到1.9的

  • PCR (2016-2-09 22:29:55)

    QUOTE:

    原帖由 greenbee 于 2016-2-9 22:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    请问LZ用什么裂解液？
    我们用的是Trizol，而有的Trizol试剂说明书写这样抽提的RNA的 A260/A280值在1.6-1.8之间，比值大于1.8我们一般考虑为基因组DNA 的污染。我最近一直在做Realtime PCR，用的模板就是通过抽提细胞的RNA经 ...
    啊？？……晕，我用的也是Trizol……会不会是不同牌子的试剂盒里面的成分会有些微妙的差别？我以前看过不同品牌的DNA试剂盒的protocol，不同的品牌的数据标准确实会有微妙的差别。

  • PCR (2016-2-09 22:30:12)

    QUOTE:

    原帖由 greenbee 于 2016-2-9 22:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')

    请问LZ用什么裂解液？
    我们用的是Trizol，而有的Trizol试剂说明书写这样抽提的RNA的 A260/A280值在1.6-1.8之间，比值大于1.8我们一般考虑为基因组DNA 的污染。我最近一直在做Realtime PCR，用的模板就是通过抽提细胞的RNA经 ...
    1.6-1.8也不错的啊，一般来说，做到1.9的是相当好的了，2-2.1的也是比较常见的。
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