【求助】pcr后跑电泳非特异性条带很多怎么办？

最新回复

• 2541 (2016-2-09 22:44:45)

  看你接来要做什么？也不一定非得消除非特异的条带

• 泡泡 (2016-2-09 22:45:02)

  
  你可以试着调整一下镁离子的浓度，最好是做一个梯度，同时应该提高退火温度，这样看看行不行。

• 了了 (2016-2-09 22:45:18)

  
  我接下来要酶切，是一定要把目的基因前面的条带消除的。提高温度我也做了，只是温度提高后，目的基因和杂带有很模糊，什么也看不见了，很是郁闷！

• kulee (2016-2-09 22:45:37)

  看来要用降落（TD）-PCR了，就是PCR开始时的退火温度高于Tm值，随着循环的进行，退火温度逐渐降到Tm值并最终低于这个水平。首先在高于引物Tm值的温度扩增几个循环，然后把退火温度逐渐降到两引物的Tm值附近，在随后的循环中，对退火温度进行梯度实验。这样能保证第一引物-模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物的反应物之间。尽管退火温度最终会降到非特异杂交的Tm值，但此时目的扩增产物已开始几何级扩增，在剩下的循环中处于超过任何非特异PCR产物的地位。因此，TD-PCR既能增加反应特异性，又能提高PCR产物的产量。

• 66小飞侠 (2016-2-09 22:45:54)

  特异带切胶，作pcr模板试一下！看看有没有多余带

• 66小飞侠 (2016-2-09 22:46:22)

  QUOTE:

  原帖由 了了 于 2016-2-9 22:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '')
  
  我接下来要酶切，是一定要把目的基因前面的条带消除的。提高温度我也做了，只是温度提高后，目的基因和杂带有很模糊，什么也看不见了，很是郁闷！ ...

  首先要确定你酶切的目的，是继续做载体连接还是不继续做了，仅仅进行酶切与否的分型。
  如果是前者，估计你的样本量应该不多，控制PCR的总量和特异条带的最高亮度的条件，然后进行切胶回收就可以了。
  如果是后者，可能相对样本量多一些。都采用切胶回收的方法固然不现实，那我觉得你不妨先不要着急想去除干净非特异性的条带，要想两全其美，起始显示中是比较困难的。你可以尝试用你需要的酶进行酶切，看看酶切后的残余片断是否会由于非特异性扩增而有质的影响。往往，非特异性扩增产物不能被酶切，或者酶切后残余条带明显偏离你需要关注的范围，那样的话是不干扰你进行基因分型的。如果需要回收片断的话，这个时候进行切胶也不晚。
  如果确实酶切后，杂带在分子量范围和亮度上都明显干扰目的条带的话，那非常不幸，你必须仔细摸索PCR条件了。

• standbyme (2016-2-09 22:46:42)

  可以试试stepdown-PCR, 逐级降低退火温度，我试过从70度开始，每3个循环降2度，直到最佳退火温度，我的是60度。同时把退火和延伸时间都缩短一点，我试过15秒，效果还不错。

• yyaxw84 (2016-2-09 22:46:57)

  
  也可以直接将目标带回收，然后再作后面的实验。这样非特异性带也就无所谓了

• 了了 (2016-2-09 22:47:15)

  我酶切是最后的一步.由于做基因多态性,所以样本数目较大,有500个左右.我也考虑过回收胶,但是费用太高.

• mybioon (2016-2-09 22:47:32)

  
  我也是！国庆之前做的条带很清楚，没有杂带。才做了20几个就开始出现杂带，每个标本都是两条杂带，只比目的条带弱一点点，在溴酚蓝后面。我调了模板，Tａｑ酶，引物的量，退火温度，反正能调整的都调整了，可以换的都换了，但是老是去不掉，有时杂带只是弱一点，但总是两条，目的条带一直有。后面还有一大批标本，我还怎么ｐ啊？接下来也是做酶切，不知道能不能就这样去切！

• tianmei001 (2016-2-09 22:47:49)

  做个touchdown吧！！可以在较高的温度上退火然后每个循环降低一度或是零点五度，直到最后你的退火温度，一般前15个循环做touchdown，后面20个循环在扩！！仅供参考！！