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【求助】请问RT-PCR提出总RNA后能否跑琼脂糖电泳检测
各位好【求助】请问RT-PCR提出总RNA后能否跑琼脂糖电泳检测
请教一个问题,我做RT-PCR,在提取到总RNA后,逆转录之前,
我想跑一个琼脂糖电泳,检验一下RNA有没有提出.
今天刚跑完一个,第一次,只看到了泳道,没有带
请各位大侠帮忙解释一下,是何原因?
因为我在制胶和配缓冲液时所用的液体都没有进行灭RNA酶处理,
这会不会影响结果,比如把RNA 分解了?还有琼脂糖的浓度有具体要求吗?
谢谢
另外,在水溶RNA时,因为没有去离子的DEPC水,我自己用双蒸水和DEPC配置的,这会不会对RNA或电泳产生影响?
谢谢
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【求助】请问RT-PCR提出总RNA后能否跑琼脂糖电泳检测
最新回复
yapuyapu (2016-2-10 14:48:13)
如果你只是希望看一下RNA的质量,强烈建议仅做普通琼脂糖电泳,采用0.5*TAE的1%普通琼脂糖电泳(同常规凝胶)在1*TAE电泳液中电泳效果很好,28S,18S和5S非常清楚,而如果降解,也非常明显,而且偶做时直接在凝胶中加EB,不会影响观察结果,屡试,保证没问题,ABSOLUTELY!不过请不要重复使用电泳液.而且液体最好是用DEPC H2O比较安全.但是如果要做NORTHERN,那还是请老老实实地配甲醛变性胶.
qqshepherd (2016-2-10 14:48:32)
我就是直接用TAE琼脂糖电泳直接跑,先看一下18s和28s,比变性甲醛电泳还好,条带清晰。但不可在胶里直接加EB,可以在上样时在样品中加,否者看不清。
双蒸水和DEPC足够了,我就用蒸馏水和DEPC。再来试试,可能是 RNA量不够。
xevin (2016-2-10 14:48:48)
乖乖!看来编书者是在梦中想到变性甲醛的?
minran_1980 (2016-2-10 14:49:25)
我有跑了一次,加了四份样本,每份3ul+3ul溴酚蓝,150V电泳,1XTBE缓冲液,1%胶。结果发现,有涌道,但涌道中没发现带。比较奇怪的是,在四个加样孔内都有一条明显的细条带,问过一个老师,他确定是带,但也没能解释原因。如果是带的话,意味着RNA在孔中没有跑出来?为什么有这种现象?
是不是我的胶浓度不合适?
另外,我刚刚做RT-PCR,不知道你们说的“先看一下18s和28s”是什么意思?该怎样看?
请Fang CY和redsun能继续给予帮助和指点。
感激。
wanglaoshi (2016-2-10 14:49:40)
关于加样孔中的细带,可能是基因组DNA。建议你还是麻烦点用变性甲醛电泳RNA。请到下面的帖子处看一下。
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=403521&sty=1&tpg=3&age=0')
finger (2016-2-10 14:49:59)
提取的总RNA在跑电泳时应该有三条带,分别是28s,18s,5s,如果RNA提取的好,电泳结果中28s:18s应该约为2:1,看一下18s和28s的意思是为了检测提取的RNA是否降解。
wzqzy (2016-2-10 14:51:45)
vcve (2016-2-10 14:52:56)
比甲醛好闻
youreyes (2016-2-10 14:53:15)
你第二次跑胶时在样孔中出现的细条带可能不是核酸,是其它的什么杂质。
跑胶检测一下总RNA是否完整提出,18s和28s及5s三条带清晰可见可以佐证你提取得较成功。
youreyes (2016-2-10 14:54:21)
我做的就是把提取的RNA直接跑电泳,对于比较完整的RNA来说跑出的3条带较为清楚。我个人的看法认为如果简单想看一看RNA的完整性普通的琼脂糖电泳即可满足要求。5s跑得最快,28s和18s距离较紧,条带亮度的比值基本是2:1。
avi317 (2016-2-10 14:54:40)
还有你在加样的时候样品与溴酚蓝的比例是不是小了呀,我觉得4:1也可以,试试看
ilovegaga (2016-2-10 14:55:13)
seagate (2016-2-10 14:56:04)
如果你只是希望看一下RNA的质量,强烈建议仅做普通琼脂糖电泳,采用0.5*TAE的1%普通琼脂糖电泳(同常规凝胶)在1*TAE电泳液中电泳效果很好,28S,18S和5S非常清楚,而如果降解,也非常明显,而且偶做时直接在凝胶中加EB,不会影响观察结果,屡试,保证没问题,ABSOLUTELY!不过请不要重复使用电泳液.而且液体最好是用DEPC H2O比较安全.但是如果要做NORTHERN,那还是请老老实实地配甲醛变性胶.
【求助】请问RT-PCR提出总RNA后能否跑琼脂糖电泳检测