【求助】 我曾经加大过菌量可是结果却提不出来

最新回复

• malong (2016-3-26 09:50:20)

  天根的效率还不错啊，你试试加大菌液，最后少加些水溶解。。

• QQ爱 (2016-3-26 09:50:39)

  、采用加富的培养基摇菌，如用超级肉汤培养基或直接将LB培养基中的酵母粉和蛋白胨加倍，仔细调节培养基的初始pH值至中性或微微偏碱性；
  2、培养基中添加170ug/ml氯霉素适当抑制菌体的增殖，促进质粒复制；
  3、注意培养过程中的通气状态。

• 兔子 (2016-3-26 09:51:00)

  多收些菌。裂解时适当增加各溶液的体积，用同一个柱子binding（多上几次）。祝好运

• p1900 (2016-3-26 09:51:20)

  SOC摇菌；换盒子；看看溶液B（SDS，碱）是不是时间长了；注意裂解充分。

• 8899 (2016-3-26 09:51:38)

  因为你用了试剂盒
  

• qinqinai (2016-3-26 09:51:58)

  质粒提取数量少，只是质粒拷贝数低，裂解的菌液量少或者不充分，柱子回收效率不高的问题！
      有时候按照正规操作提取质粒，也有提不出来的现象是，可能是质粒丢失了-原因不知！
      楼主可以这样：
      1对冻存的原始菌液做抗性划线培养，一来借助抗生素纯化质粒，二来也提高了菌活性液。
      2随机挑选几个单克隆扩摇，用报告基因或者启动子序列作为Pcr对象进行检测或者合适酶的酶切检测验证-可以放后面做，一般都对！
      3最大限度地提高菌体活性，先对正确的克隆小管扩摇，然后再抽取新鲜菌液再扩摇！
      4注意培养条件，培养时间不宜过长，一般8-12小时或15小时以内吧！
      5按比例加大样试剂总量，提取过程注意几个细节，比如缓慢混匀，裂解后静止等！
      6用60度左右预热的水洗脱，洗脱两遍，注意水的用量。
      7可以加多水洗脱后，利用抽真空法浓缩质粒！
      8有些盒子对质粒大小也有要求，应细看说明书！

• 双子座 (2016-3-26 09:52:17)

  拷贝的质粒确实 不是很好提取，所以菌液量一般是加倍的。但是菌液加倍后，相应地溶液I、II、III也应该加倍。也可以是分成两管菌来裂解，离心后上清加入到同一个纯化柱。
  其实你的目的只是质粒转化，质粒转化的效率比连接产物要高，哪怕是浓度很低条带很亮，也可以先试着转化的，没必要在提取这个问题纠缠这么久

• aaby (2016-3-26 09:52:37)

  有几个情况：
  第一是你放置的菌液时间太长，质粒已经消失
  第二是你最后加水溶解时加的太多，导致浓度较低
  第三是你的质粒拷贝数低，有可能使菌的活化程度不够，可适当多培养几次，再提取质粒
  这是我做实验的几点心得，望对你有用

• p1900 (2016-3-26 09:52:55)

  拷贝数低，最好大量抽提质粒，我们提取拷贝数低的质粒一般用威格拉斯大抽试剂盒提取

• 青青草 (2016-3-26 09:53:17)

  是的，我用天根的，您是怎么做的呢？非常好奇

• 大嘴猴 (2016-3-26 09:53:36)

  就是只要我提取出来了，不用管浓度高低都可以进行转化实验啦？

• rrra6 (2016-3-26 09:54:00)

  加大菌量结果提不出来了，可能细菌太多不能全部裂解有关，我想做细菌质粒转化实验，用DH5α，是不是只要提取成功了就可以做啊？

• yayayu (2016-3-26 09:54:20)

  是的，只要有质粒，所以可以试试加1,5,10ul的质粒来分别转化，挑菌看看是否阳性。一般来说质粒转化几乎都是阳性

• wawa11 (2016-3-26 09:54:40)

  不要用试剂盒提。人工法提吧，自己配几个溶液I\II\III就可以了，我们这边用人工法能提出500ng/ul的量。

• 燕子@ (2016-3-26 09:55:00)

  见15楼，自己配配溶液I，II，III提取就行了。

• 双子座 (2016-3-26 09:55:44)

  能否告知溶液I，II，III溶液的配方？实验操作步骤？感谢

• 钻石 (2016-3-26 09:56:03)

  能否把溶液I，II，III和最后的洗脱液如何配置，以及实验操作步骤告知呢？静待回复，感谢。

• 大花猫bb (2016-3-26 09:56:25)

  就是最普遍的碱法提取
  溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0），加RNase。
  配制方法：1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在121℃高压灭菌15min ，贮存于4℃。
  溶液Ⅱ：0.2M NaOH，1% SDS。
  配制方法：2M NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。
  溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。
  配制方法：5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存备用。
  苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）

• wawa11 (2016-3-26 09:56:48)

  最后检测浓度的时候，230的峰突出了，是什么原因你了解吗？怎么才能解决这个问题呢？求赐教。 我提了好多次，可是一直有这个问题，不知道什么原因。。。

• yayayu (2016-3-26 09:57:11)

  230峰值高表明溶液内盐离子浓度较大！
  如果使用试剂盒提取的话，建议漂洗的时候适当加大离心力，漂洗两遍后要按照说明再空离心几分钟，可有效降低离子浓度。洗脱可以用自己的双蒸水，也可以启到效果！
  如果是自己配置的试剂提取的，沉淀下来的产物需要用70-75%酒精漂洗，目的也是去除盐离子等杂质，然后离心沉淀，然后吸去多余酒精，风干后用超纯水溶解就是了！