【求助】提质粒的时候加了３ｍｌ菌液，

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• 886爱 (2016-3-26 09:58:15)

  ET28拷贝数不高
  还有，干嘛要摇两次？为什么不拿菌液PCR剩下的菌提质粒？还有，没必要菌液PCR，容易出假阳性

• huali (2016-3-26 09:58:34)

  因为只有3ml菌液，那天提了一下质粒，发现浓度很低，于是重新摇菌加大菌液量提，浓度还是很低。刚刚用这一批浓度很低的质粒（最大的一管浓度70ng/ul,峰也很正常）做双酶切跑完电泳竟然什么也没有，那我提的到底是啥呀，pcr阳性又是咋出来的？

• wawa11 (2016-3-26 09:58:53)

  提质粒的菌液增加到5~6ml，按照质粒提取kit说明提高得率
  质粒PCR
  酶切反应体系不要用水，全部用质粒。或者你把酶切体系发一下
  至于菌液PCR为什么容易出假阳性，自己找找

• 美人鱼 (2016-3-26 09:59:18)

  我查过了。想起当时做菌液pcr的时候扩增出的条带并没有当初连T载体的时候菌液pcr的那么亮，也许真的可能是假阳性。
  酶切体系我全部用的提的质粒，没有水。可是跑空质粒也是什么条带也没有。所以我怀疑质粒根本没有转进去。
  可是为啥质粒没转进去菌还能在有抗生素的板子和菌液里长呢？？好奇怪

• daomei (2016-3-26 09:59:39)

  啊 说错了 不是空质粒，是酶切前的质粒

• 妮子@ (2016-3-26 09:59:59)

  看来楼主和我一样(⊙o⊙)我送出去测序都没信号，这个低拷贝太坑爹了！

• rrra6 (2016-3-26 10:00:21)

  用过psc101*/ts么  那个拷贝数才低
  pet系列这种pbr322的随便做也很容易看到。

• 蓝色雨梦 (2016-3-26 10:00:41)

  那童鞋你提出来的质粒浓度多少，双酶切验证有条带么？

• 小熊妮妮 (2016-3-26 10:01:00)

  没测浓度，跑电泳时与maker对比，估计有50ng/ul吧。双酶切有很虚弱的条带

• xiaoxiaoai (2016-3-26 10:01:20)

  加氯霉素延长培养时间。
  或者中提大提

• 今生如此 (2016-3-26 10:01:38)

  我咋觉得里面根本没有质粒呢，不然不会提出的质粒测浓度都70了跑电泳还没条带

• 冰激凌 (2016-3-26 10:01:58)

  有考虑过抗性失效了吗？
  或者长出的单菌落是假阳性（卫星斑）