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【求助】如何在BLAST里寻求引物所能扩增目的片段的长度?
各位高手,向你们请教:【求助】如何在BLAST里寻求引物所能扩增目的片段的长度?
我从文献上查到我想要的引物,但文献上并没写此引物所能扩出的目的片段的大小,如何用某种工具如BLAST去找到该引物所能扩出的目的片段长度呢?万分感谢你们的帮助!
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【求助】如何在BLAST里寻求引物所能扩增目的片段的长度?
字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2016-4-06 10:51 作者: langlang 来源: 分析测试百科网
最新回复
SO2 (2016-4-06 10:52:09)
langlang (2016-4-06 10:54:18)
谢谢楼上的热情帮助,但我还是不太会找,比如我要扩小鼠的IL-4,文献中的引物为上游: 5’-TCGGCATTTTGAACGAGGTC-3’;下游:5’-GAAAAGCCCGAAAGAGTCTC-3’,从BLAST搜到如下结果,那哪个是呢?"上下游引物能100%互补"是指谁和谁互补,怎么个互补法呢? 这个问题已经困扰我很久,万分感谢你们的再次帮助.
langlang (2016-4-06 10:55:30)
any333 (2016-4-06 11:10:49)
楼主所用的引物在DNA和RNA中均能扩出来,下面这个是以DNA为模板扩出的片段,长度=91574-86987+1(bp)=4588bp
gi|3687208|gb|AC005742.1| Mus musculus chromosome 11, BAC clone CT7-111I18 (LBNL M01),
complete sequence
Length=159500
Score = 44.1 bits (22), Expect = 0.017
Identities = 22/22 (100%), Gaps = 0/22 (0%)
Strand=Plus/Plus
Query 19 TCGAAAAGCCCGAAAGAGTCTC 40
||||||||||||||||||||||
Sbjct 86987 TCGAAAAGCCCGAAAGAGTCTC 87008
Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27
Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%)
Strand=Plus/Minus
Query 1 TCGGCATTTTGAACGAGGTC 20
||||||||||||||||||||
Sbjct 91574 TCGGCATTTTGAACGAGGTC 91555
下面这个是以RNA为模板扩出的片段,长度=379-162+1(bp)=218bp
>gi|51826|emb|X03532.1|MMIGG1R Mouse mRNA for IgG1 induction factor
Length=580
Score = 44.1 bits (22), Expect = 0.017
Identities = 22/22 (100%), Gaps = 0/22 (0%)
Strand=Plus/Minus
Query 19 TCGAAAAGCCCGAAAGAGTCTC 40
||||||||||||||||||||||
Sbjct 379 TCGAAAAGCCCGAAAGAGTCTC 358
Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27
Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%)
Strand=Plus/Plus
Query 1 TCGGCATTTTGAACGAGGTC 20
||||||||||||||||||||
Sbjct 162 TCGGCATTTTGAACGAGGTC 181
any333 (2016-4-06 11:11:07)
1、以RNA反转录所得的cDNA为模板,扩增产物为216bp(403-188+1)。
>gi|10946583|ref|NM_021283.1| Mus musculus interleukin 4 (Il4), mRNA
Length=605
Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.089
Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%)
Strand=Plus/Plus
Query 1 TCGGCATTTTGAACGAGGTC 20
||||||||||||||||||||
Sbjct 188 TCGGCATTTTGAACGAGGTC 207
Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.089
Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%)
Strand=Plus/Minus
Query 26 GAAAAGCCCGAAAGAGTCTC 45
||||||||||||||||||||
Sbjct 403 GAAAAGCCCGAAAGAGTCTC 384
2、以基因组DNA为模板,扩增产物为4586bp(91574-86989+1)
>gi|3687208|gb|AC005742.1| Mus musculus chromosome 11, BAC clone CT7-111I18 (LBNL M01),
complete sequence
Length=159500
Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.089
Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%)
Strand=Plus/Plus
Query 26 GAAAAGCCCGAAAGAGTCTC 45
||||||||||||||||||||
Sbjct 86989 GAAAAGCCCGAAAGAGTCTC 87008
Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.089
Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%)
Strand=Plus/Minus
Query 1 TCGGCATTTTGAACGAGGTC 20
||||||||||||||||||||
Sbjct 91574 TCGGCATTTTGAACGAGGTC 91555
对于所设计的引物,上游引物应该与模板序列某段完全相同、下游引物应该与模板序列的某段完全互补。下面看看用你的引物序列BLAST的结果,Identities后面的是引物序列与基因序列某段的匹配程度(如,100%),Query后面的是用于BLAST的引物序列,Sbjct后面的是与引物序列匹配的基因的某段序列。从BLAST结果可以看出,你的上游引物与小鼠IL-4基因序列的某段完全相同(注意上面的红色部分);你的下游引物与小鼠IL-4基因序列的某段互补且完全匹配(注意上面的蓝色部分)。
langlang (2016-4-06 11:11:26)
langlang (2016-4-06 11:11:44)
ero11 (2016-4-06 11:12:15)
我和zzy1895所选的基因实际上都是同一个基因,即小鼠的IL-4(见下面的Other Aliases)。所不同的是,我选的是经NCBI整理过的、公认的小鼠的IL-4基因序列。
Il4
Official Symbol: Il4 and Name: interleukin 4 [Mus musculus]
Other Aliases: RP23-188H3.4, IgG1, Il-4
Chromosome: 11; Location: 11 29.0 cM
GeneID: 16189
他是选择了1-20 19-40,你选的是1-20 26-45,为什么会有不同选择呢?
这不是有不同的选择的问题,而是我和zzy1895进行BLAST时所用的序列有所不同。我用的序列是“上游引物”+nnnnn+“下游引物”,即TCGGCATTTTGAACGAGGTC nnnnnGAAAAGCCCGAAAGAGTCTC ;而zzy1895进行BLAST时用的序列应该是“上游引物”+“下游引物”,即TCGGCATTTTGAACGAGGTC GAAAAGCCCGAAAGAGTCTC 。结果虽然看起来不一样,但实际上是一样的。对于zzy1895的BLAST结果,必须用你的引物序列和BLAST结果进行比较,找出引物在基因序列上的确切位置,这样才能准确算出扩增产物的长度。以zzy1895 BLAST结果中的、以mRNA为模板计算扩增产物长度为例(见下面),你的上游引物在该基因序列上的位置是162-181(见红色部分),下游引物在该基因序列上所对应的位置应该是377-358而不是379-358(见蓝色部分),所以扩增产物长度应该是216bp(377-162+1)而不是218bp(379-162+1)。
>gi|51826|emb|X03532.1|MMIGG1R Mouse mRNA for IgG1 induction factor
Length=580
Score = 44.1 bits (22), Expect = 0.017
Identities = 22/22 (100%), Gaps = 0/22 (0%)
Strand=Plus/Minus
Query 19 TCGAAAAGCCCGAAAGAGTCTC 40
||||||||||||||||||||||
Sbjct 379 TCGAAAAGCCCGAAAGAGTCTC 358
Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27
Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%)
Strand=Plus/Plus
Query 1 TCGGCATTTTGAACGAGGTC 20
||||||||||||||||||||
Sbjct 162 TCGGCATTTTGAACGAGGTC 181
ero11 (2016-4-06 11:12:39)
不好意思,还想向楼上请教,很难得遇见象你和zzy1895这么细心,耐心,水平高又热心的老师,为什么在我的下游引物前会多出来TC呢?
Query 19 TCGAAAAGCCCGAAAGAGTCTC 40
||||||||||||||||||||||
Sbjct 379 TCGAAAAGCCCGAAAGAGTCTC 358
wanglaoshi (2016-4-06 11:12:57)
“他是选择了1-20 19-40,你选的是1-20 26-45,为什么会有不同选择呢? " ,实际上, 具体选择哪个片断不是看上列,而应看下列,上列是楼主自己输入的,而下列才是特异性序列在核酸中的位置。另外,只要楼主的RNA提得纯度高,没有DNA污染,就不用担心扩出基因组的片断来。
langlang (2016-4-06 11:13:19)
不好意思,我的问题比较多,我是初学者,还很少有机会向高手请教,几乎全靠在园子里浏览大家的精彩讨论,学到很多东西,本次发贴也是实在自己冥思苦想也无果的举措.
我在用文献中查到IFN- gamma的引物找其所扩片段大小时,(上游: 5’-GCTCTGAGACAATGAACGCT-3’ 下游:5’-AAAGAGATAATCTGGCTCTGC-3’)发现结果:
>gi|26354598|dbj|AK089574.1| Mus musculus activated spleen cDNA, RIKEN full-length enriched
library, clone:F830002I10 product:interferon gamma, full insert
sequence
Length=1208
Score = 42.1 bits (21), Expect = 0.019
Identities = 21/21 (100%), Gaps = 0/21 (0%)
Strand=Plus/Plus
Query 1 GCTCTGAGACAATGAACGCTA 21
|||||||||||||||||||||
Sbjct 99 GCTCTGAGACAATGAACGCTA 119
Score = 42.1 bits (21), Expect = 0.019
Identities = 21/21 (100%), Gaps = 0/21 (0%)
Strand=Plus/Minus
Query 21 AAAGAGATAATCTGGCTCTGC 41
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Sbjct 327 AAAGAGATAATCTGGCTCTGC 307
即上游引物Query 1 GCTCTGAGACAATGAACGCTA 21
后面比我的引物多出来一个A,我也不知道是原文献中在印刷时少打了一个"A"?还是不要这个"A"也能扩增出想要的目的片段呢?我要想合成引物,要不要把"A"加在后面呢?
不好意思,耽误大家的保贵时间了
wanglaoshi (2016-4-06 11:13:39)
【求助】如何在BLAST里寻求引物所能扩增目的片段的长度?