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标题:【求助】抗体杂质检测项中的HCP残留酶联免疫检测...

大桃子同学[使用道具]
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【求助】抗体杂质检测项中的HCP残留酶联免疫检测...


我们用的Cygnus F550 CHO HCP ELISA kit,现在在做方法验证,专属性怎么做?希望有单抗药物临床申报经验的同行给点意见。
中检院曾指出过“对于不同的目的蛋白质,根据分子量大小和等电点的不同,会采取不同的分离纯化工艺。不同的分离纯化工艺会导致细胞蛋白残留量和组成上的较大差异。只有根据不同的生产工艺,制备工艺特异的细胞蛋白标准品和特异的抗血清,建立相应的检测方法,才能更真实反应供试品的’细胞蛋白残留量。”
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shanzhapia696[使用道具]
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商业化的HCP kit检测的结果只能代表通用的那些HCP的含量和比例,但是每个项目都有其特异的HCP比例,且各个蛋白对HCP的检测干扰程度不一样,所以见了专属的HCP检测方法是非常必要的。我们公司申报的一个产品,就被CDE要求补充特异的HCP检测方法。
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ukonptp[使用道具]
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HCP抗体制备很少有免疫老鼠制备抗体的。cygnus试剂盒及abcam公司中的HCP抗体是羊多抗或兔多抗,这样的好处很明显,一次制备量可以够用几年甚至上十年,也避免不同制备批次间的差异。如后期工艺稳定,考虑工艺特异性,可另外再制备工艺特异性抗体,适合申报注册等。工艺特异抗原的制备,就是空白菌经过相同的发酵及纯化条件处理后所得,当然,纯化至哪一步,这个就得具体问题,具体分析了,不建议到最后一步,虽然针对性会更强,但不能保证不会缺失部分HCP,建议层析一步或两步,目的蛋白纯度达到一定要求就可以了。
HCP制备中免疫原性差异的问题是难以避免的,abcam公司针对大肠低分子量HCP的抗体,货号为ab181642,大家可以了解下。
对了,关于专属性验证问题,我们这里只考察了基质的影响。其实,houjinglhy 所说的也不错,可找其他相关蛋白验证,如你是CHO HCP试剂盒,是不是可以检测大肠或酵母的HCP,看是否存在交叉反应?
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8s5g[使用道具]
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专属性就是找一些市售的抗体药物或无关蛋白看看它的交叉反应吧。CNKI上有几篇做疫苗的宿主蛋白残留方法学的文章是这么做的,你可以参考下。但不知道这个对重组单抗适不适应。
一般宿主蛋白对照品都是通过裂解或冻融宿主细胞制备的。中检院的意思是你需要把通过裂解或冻融提取的宿主蛋白在你的整个工艺流程中走一遍,最后通过富集来获得“特异性的宿主蛋白”标准品。首先你的知道怎么富集宿主蛋白,其次你得要大量的宿主蛋白和工艺量才能获得足量的宿主蛋白。这个类似于化药里面自制杂质对照品一样。真要这么做代价也太大了吧。。。 还有你引用的这些话是从文件里看到的吗?何种渠道得知的
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hulu呼噜[使用道具]
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这个地方的专属性指的是做你的缓冲液基质的影响,抗体特异性是试剂盒要证明针对细胞宿主蛋白的。
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大桃子同学[使用道具]
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原帖由 8s5g 于 2016-4-11 22:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

专属性就是找一些市售的抗体药物或无关蛋白看看它的交叉反应吧。CNKI上有几篇做疫苗的宿主蛋白残留方法学的文章是这么做的,你可以参考下。但不知道这个对重组单抗适不适应。
一般宿主蛋白对照品都是通过裂解或冻融宿 ...

中检院一篇旧的文献中看到的。上周在研讨会上听到Cygnus 3rd Generation CHO HCP kit在CHO-K、CHO-S、DG44三种细胞系中的检出率均只有60%左右,是通过2D WB和LCMSMS两种方法比较的。如果回收率60%左右,专属性验证是否就通不过了? 如果Cygnus的试剂盒升级了,换用同种升级的试剂盒是否还要重新验证?
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8s5g[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 大桃子同学 于 2016-4-11 22:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

中检院一篇旧的文献中看到的。上周在研讨会上听到Cygnus 3rd Generation CHO HCP kit在CHO-K、CHO-S、DG44三种细胞系中的检出率均只有60%左右,是通过2D WB和LCMSMS两种方法比较的。如果回收率60%左右,专属性验证是否 ...

你这个说的是属于检测灵敏度吧,专属性考察溶液或其他物质对方法的干扰
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toy[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 大桃子同学 于 2016-4-11 22:29 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

中检院一篇旧的文献中看到的。上周在研讨会上听到Cygnus 3rd Generation CHO HCP kit在CHO-K、CHO-S、DG44三种细胞系中的检出率均只有60%左右,是通过2D WB和LCMSMS两种方法比较的。如果回收率60%左右,专属性验证是否 ...

一般好像都是用Cygnus的试剂盒检测HCP的,专属性问题可以用293细胞株的宿主蛋白作为对照说明对CHO细胞株的专属性。
HCP蛋白制备,可以用稳定细胞株的空白宿主细胞株转染对应的空载体然后筛选到细胞株(不直接用宿主细胞株,这样可以更全面的说明HCP),进行补料培养取上清进行制备HCP(HCP的制备方法各显神通 )。将制备好的HCP进行定量(蛋白定量方法很多种 ),用定量好的HCP来建立验证检验HCP的方法。
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大桃子同学[使用道具]
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说错了,这个应该归于准确性。因为HCP标准品是试剂盒提供的,跟自己产品中HCP肯定有差异,我们要确认是Cygnus的这个试剂盒能否检出我们自己产品中所有种类的HCP?因为我们用的CHO-S表达系统,根据上图Millipore的实验研究,其检出率只有50~65%,是不是就说明我们用这个试剂盒进行检测放行时,它的检测结果是低于真实值的?


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大桃子同学[使用道具]
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说错了,这个应该归于准确性。因为HCP标准品是试剂盒提供的,跟自己产品中HCP肯定有差异,我们要确认是Cygnus的这个试剂盒能否检出我们自己产品中所有种类的HCP?因为我们用的CHO-S表达系统,根据上图Millipore的实验研究,其检出率只有50~65%,是不是就说明我们用这个试剂盒进行检测放行时,它的检测结果是低于真实值的?


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